Análise de dados públicos
Os dados sobre as linhagens SARS-CoV-2 e a data em que a amostra foi retirada das sequências disponíveis no Chile foram obtidos no site Consorcio Genomas CoV2 disponível em https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Os dados de vacinação foram obtidos a partir de dados públicos do Ministério da Ciência, Tecnologia, Conhecimento e Inovação disponíveis em https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produto 83).
Ensaio de infectividade
Os vírus pseudotipados carregando diferentes proteínas de pico SARS-CoV-2 foram preparados como descrito anteriormente12. Resumidamente, pseudótipos de SARS-CoV-1 baseados em HIV-2 foram produzidos em células HEK293T por transfecção do pNL4.3-ΔEnv-Luc juntamente com o vetor de codificação de pico pCDNA-SARS-CoV-2 correspondente em uma razão molar de 1: 1. Plasmídeos que codificam um pico otimizado por códons sem os últimos 19 aminoácidos da extremidade C-terminal (SΔ19) conhecido por evitar a retenção no retículo endoplasmático12 foram obtidos por síntese de genes ou mutagênese direcionada ao local personalizado (GeneScript) e continham as seguintes mutações: linhagem A (sequência de referência), linhagem B (D614G), linhagem B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), linhagem P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) e linhagem C.37-75I, T76I) e linhagem C.246-252 (G452I, T490I). 614, L859Q, F3,000S, D1G, T24N). Cada preparação de pseudótipo foi depurada por centrifugação a 50 rpm à temperatura ambiente, quantificada usando o kit HIV-80 Gag p1 Quantikine ELISA (R&D Systems), aliquotada em 24% de soro fetal bovino (Sigma-Aldrich) e armazenada a -2 ° C até usar. Diferentes quantidades de vírus pseudotipados (conforme determinado pelos níveis da proteína p48 do HIV-96) foram usadas para infectar células HEK-ACEXNUMX e XNUMX horas depois, a atividade da luciferase do pirilampo foi medida usando o reagente de ensaio de luciferase (Promega) em uma microplaca Glomax XNUMX luminômetro (Promega).
Ensaio de neutralização
Os ensaios de neutralização de vírus pseudotipados foram realizados essencialmente como descrito anteriormente12. Resumidamente, diluições em série das amostras de plasma (1: 4 a 1: 8748) foram preparadas em DMEM com 10% de soro fetal bovino e incubadas com 5 ng de p24 de cada vírus pseudotipado durante 1h a 37 ° C e, em seguida, 1 × 104 de células HEK-ACE2 foram adicionadas a cada poço. Células HEK293T (não expressando ACE2) incubadas com o vírus pseudotipado (linhagem A) foram utilizadas como controle negativo. As células foram lisadas 48 horas depois, e a atividade da luciferase do pirilampo foi medida usando o Luciferase Assay Reagent (Promega) em um luminômetro Glomax 96 Microplate (Promega). A porcentagem de neutralização para cada diluição foi calculada e o ID50 de cada amostra foi calculado usando GraphPad Prism versão 9.0.1.
análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism versão 9.1.2. Comparações de múltiplos grupos para títulos de anticorpos neutralizantes (NAbTs) contra um painel de vírus pseudotipados SARS-CoV-2, bem como comparações de respostas de NAbs por sexo e status de fumo, foram realizadas usando um teste de classificação assinado de Wilcoxon emparelhado. A alteração do fator foi calculada como a diferença do título médio geométrico no ID50 em comparação com o vírus pseudotipado de tipo selvagem. A análise de correlação entre NAbTs e idade ou IMC foi realizada por meio do teste de Spearman. ANOVA unilateral e teste de comparação múltipla de Tukey foram realizados para análise estatística de infectividade. Um valor de p ≤ 0.05 foi considerado estatisticamente significativo.
Aprovação ética
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade do Chile (Projetos N ° 0361-2021 e N ° 096-2020) e Clínica Santa Maria (Projeto N ° 132604-21). Todos os doadores assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e suas amostras foram anônimas.
Impacto das mutações de pico na variante Lambda na infecciosidade e nas respostas de anticorpos neutralizantes
Uma análise de 3695 sequências do Chile depositadas no GISAID em 24 de junhoth 2021 mostra um claro predomínio das variantes Gamma e Lambda do SARS-CoV-2 durante o último trimestre, contabilizando, juntas, 79% de todas as sequências.
Curiosamente, este período foi caracterizado por uma campanha massiva de vacinação na qual 65.6% da população-alvo (indivíduos com 18 anos ou mais) receberam um esquema de vacinação completo em 27 de junho.th 2021
Considerando que 78.2% das pessoas inoculadas com esquema completo receberam a vacina de vírus inativado CoronaVac da Sinovac Biotech, buscou-se investigar o impacto das mutações de pico presentes na variante Lambda sobre a capacidade neutralizante dos anticorpos eliciados por esta vacina.
Para isso, geramos vírus pseudotipados SARS-CoV-1 baseados em HIV-2 que transportam a proteína spike da linhagem de referência Wuhan-1 (tipo selvagem; linhagem A), a mutação D614G (linhagem B) e a Alfa (linhagem B .1.1.7), variantes Gamma (linhagem P.1) e Lambda (linhagem C.37).
Durante a preparação do vírus, observamos de forma consistente que as células infectadas com o vírus pseudotipado carregando o pico Lambda produziram valores de bioluminescência significativamente mais elevados em comparação com o mutante D614G ou as variantes Alfa e Gama, indicando um aumento da infecciosidade impulsionado pela proteína do pico Lambda
Figura 1. Painel doInfectividade mediada por diferentes proteínas de pico.
(A) Representação esquemática da proteína spike SARS-CoV-2 e as variantes utilizadas neste estudo. As linhagens são indicadas entre parênteses. RBD, domínio de ligação ao receptor, CM; cauda citoplasmática.
(B) Titulação dos pseudótipos de cada linhagem usando quantidades equivalentes de HIV-1 p24. A atividade da luciferase do vaga-lume foi medida como unidades de luminescência relativa (RLU) 48 horas após a infecção. A média e o SD foram calculados a partir de um experimento triplicado representativo.
Em seguida, usamos os vírus pseudotipados mencionados acima para realizar ensaios de neutralização usando 79 amostras de plasma de profissionais de saúde saudáveis da Universidad de Chile e Clínica Santa María em Santiago, Chile.
Excluímos 4 amostras porque não fomos capazes de calcular um título ID50. Das amostras analisadas, 73% correspondiam a mulheres, idade mediana de 34 anos (IQR 29 - 43) e índice corporal máximo (IMC) de 25 (IQR 22.7 - 27). 20.5% dos participantes declararam ser fumantes ativos durante o período de vacinação. As amostras foram obtidas em uma média de 95 dias (IQR 76 - 96) após a segunda dose da vacina CoronaVac
Observamos que a neutralização do vírus pseudotipado carregando a proteína spike do tipo selvagem resultou em uma diluição inibitória de 50% (ID50) título médio de 191.46 (154.9 - 227.95, IC de 95%), enquanto era 153.92 (115.68 - 192.16, IC de 95%), 124.73 (86.2 - 163.2, IC de 95%), 104.57 (75.02 - 134.11, IC de 95% ) e 78.75 (49.8 - 107.6, 95% CI) para vírus pseudotipados que transportam a proteína spike do mutante D614G ou as variantes Alfa, Gama e Lambda, respectivamente.
Também observamos que o título médio geométrico do ID50 os títulos diminuíram por um fator de 3.05 (2.57 - 3.61, IC 95%) para o vírus pseudotipado com o pico Lambda, 2.33 (1.95 - 2.80, IC 95%) para o pico Gama, 2.03 (1.71 - 2.41, IC 95%) para o pico Alpha e 1.37 (1.20-1.55, IC 95%) para o pico D614G em comparação com o pico do tipo selvagem.
Nenhuma correlação entre sexo, idade, índice de massa corporal (IMC) ou tabagismo e títulos de anticorpos neutralizantes foi observada em nossa coorte de estudo.
Figura 2. Painel doEnsaio de neutralização usando amostras de plasma de vacinados CoronaVac
(A) Mudanças no título recíproco de neutralização de 50% (ID50) em amostras de plasma de 75 receptores da vacina CoronaVac contra o D614G (linhagem B), Alpha (linhagem B.1.1.7),
Variantes Gamma (linhagem P.1) e Lambda (linhagem C.37) em comparação com o vírus do tipo selvagem. Os resultados são apresentados como a diferença nos títulos de neutralização de amostras correspondentes. Valores P para a comparação do ID50 são calculados com o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon.
(B) Os gráficos de caixa indicaram a mediana e o intervalo interquartil (IQR) de ID50 para cada vírus pseudotipado. As mudanças de fator são mostradas como a diferença do título médio geométrico no ID50 em comparação com os do vírus pseudotipado de tipo selvagem. As análises estatísticas foram realizadas usando o teste de postos sinalizados de pares combinados de Wilcoxon.
Juntos, nossos dados revelaram que a proteína spike da variante de interesse recém-reconhecida Lambda, com grande circulação no Chile e em países da América do Sul, carrega mutações que conferem maior infectividade e a capacidade de escapar dos anticorpos neutralizantes produzidos pelo CoronaVac.
