Hora da morte: nova tecnologia necessária para maior precisão

Para os pesquisadores que estudam a neurodegeneração, essa falta de uma declaração precisa da “hora da morte” para os neurônios torna difícil determinar quais fatores levam à morte celular e rastrear drogas que podem salvar as células envelhecidas da morte.              

Agora, os pesquisadores do Gladstone Institutes desenvolveram uma nova tecnologia que lhes permite rastrear milhares de células ao mesmo tempo e determinar o momento preciso da morte de qualquer célula do grupo. A equipe mostrou, em um artigo publicado na revista Nature Communications, que a abordagem funciona em células de roedores e humanos, bem como em peixes-zebra vivos, e pode ser usada para acompanhar as células por um período de semanas a meses.

“Obter a hora exata da morte é muito importante para desvendar causa e efeito em doenças neurodegenerativas”, disse Steve Finkbeiner, MD, PhD, diretor do Centro de Sistemas e Terapêutica em Gladstone e autor sênior de ambos os novos estudos. “Isso nos permite descobrir quais fatores estão causando diretamente a morte celular, quais são acidentais e quais podem ser mecanismos de enfrentamento que retardam a morte”.

Em um artigo complementar publicado na revista Science Advances, os pesquisadores combinaram a tecnologia de sensor de células com uma abordagem de aprendizado de máquina, ensinando um computador a distinguir células vivas e mortas 100 vezes mais rápido e com mais precisão do que um humano.

“Os estudantes universitários levaram meses para analisar esses tipos de dados manualmente, e nosso novo sistema é quase instantâneo - na verdade, funciona mais rápido do que podemos adquirir novas imagens no microscópio”, diz Jeremy Linsley, PhD, líder de programa científico em Finkbeiner's lab e o primeiro autor de ambos os novos artigos.

Ensinando novos truques a um sensor antigo

Quando as células morrem - seja qual for a causa ou mecanismo - elas eventualmente se fragmentam e suas membranas degeneram. Mas esse processo de degradação leva tempo, tornando difícil para os cientistas distinguir entre células que há muito pararam de funcionar, aquelas que estão doentes e morrendo e aquelas que estão saudáveis.

Os pesquisadores normalmente usam marcadores fluorescentes ou corantes para acompanhar as células doentes com um microscópio ao longo do tempo e tentar diagnosticar onde elas estão dentro do processo de degradação. Muitos corantes indicadores, manchas e rótulos foram desenvolvidos para distinguir as células já mortas daquelas que ainda estão vivas, mas muitas vezes eles funcionam apenas por curtos períodos de tempo antes de desbotarem e também podem ser tóxicos para as células quando são aplicados.

“Queríamos realmente um indicador que durasse toda a vida de uma célula - não apenas algumas horas - e que desse um sinal claro somente após o momento específico em que a célula morre”, diz Linsley.

Linsley, Finkbeiner e seus colegas cooptaram sensores de cálcio, originalmente projetados para rastrear os níveis de cálcio dentro de uma célula. À medida que uma célula morre e suas membranas vazam, um dos efeitos colaterais é que o cálcio penetra no citosol aquoso da célula, que normalmente tem níveis relativamente baixos de cálcio.

Então, Linsley projetou os sensores de cálcio para residir no citosol, onde eles fluorescariam apenas quando os níveis de cálcio aumentassem a um nível que indica morte celular. Os novos sensores, conhecidos como indicador de morte codificado geneticamente (GEDI, pronunciado como Jedi em Star Wars), podem ser inseridos em qualquer tipo de célula e sinalizar que a célula está viva ou morta durante toda a vida da célula.

Para testar a utilidade dos sensores reprojetados, o grupo colocou grandes grupos de neurônios - cada um contendo GEDI - sob o microscópio. Depois de visualizar mais de um milhão de células, em alguns casos sujeitas a neurodegeneração e em outros expostas a compostos tóxicos, os pesquisadores descobriram que o sensor GEDI era muito mais preciso do que outros indicadores de morte celular: não houve um único caso em que o sensor foi ativado e uma célula permaneceu viva. Além disso, além dessa precisão, o GEDI também parecia detectar a morte celular em um estágio anterior do que os métodos anteriores - perto do “ponto sem retorno” para a morte celular.

“Isso permite que você separe as células vivas das mortas de uma forma que nunca foi possível antes”, diz Linsley.

Detecção de morte sobre-humana

Linsley mencionou o GEDI a seu irmão - Drew Linsley, PhD, um professor assistente na Brown University que se especializou na aplicação de inteligência artificial a dados biológicos em grande escala. Seu irmão sugeriu que os pesquisadores usassem o sensor, juntamente com uma abordagem de aprendizado de máquina, para ensinar um sistema de computador a reconhecer células cerebrais vivas e mortas com base apenas na forma da célula.

A equipe combinou os resultados do novo sensor com dados de fluorescência padrão nos mesmos neurônios e ensinou um modelo de computador, chamado BO-CNN, para reconhecer os padrões típicos de fluorescência associados à aparência das células morrendo. O modelo, os irmãos Linsley mostraram, era 96% preciso e melhor do que o que os observadores humanos podem fazer, e era mais de 100 vezes mais rápido do que os métodos anteriores de diferenciação de células vivas e mortas.

“Para alguns tipos de células, é extremamente difícil para uma pessoa perceber se uma célula está viva ou morta - mas nosso modelo de computador, ao aprender com o GEDI, foi capaz de diferenciá-los com base em partes das imagens que não conhecíamos anteriormente foram úteis para distinguir células vivas e mortas ”, diz Jeremy Linsley.

Tanto o GEDI quanto o BO-CNN agora permitirão aos pesquisadores realizar novos estudos de alto rendimento para descobrir quando e onde as células cerebrais morrem - um desfecho muito importante para algumas das doenças mais importantes. Eles também podem rastrear drogas quanto à sua capacidade de retardar ou evitar a morte celular em doenças neurodegenerativas. Ou, no caso do câncer, podem procurar medicamentos que aceleram a morte das células doentes.

“Essas tecnologias mudam o jogo em nossa capacidade de entender onde, quando e por que a morte ocorre nas células”, diz Finkbeiner. “Pela primeira vez, podemos realmente aproveitar a velocidade e a escala fornecidas pelos avanços na microscopia assistida por robô para detectar com mais precisão a morte celular, e fazer isso bem antes do momento da morte. Esperamos que isso possa levar a uma terapêutica mais específica para muitas doenças neurodegenerativas que até agora eram incuráveis. ”